Bakgrunn for tidlig diagnostikk av paratuberkulose hos geit og storfe

Anne K. Storset
Institutt for FMN
Norges Veterinærhøgskole
Postboks 8146 dep.
0033 OSLO

Artikkel i Norsk Veterinærtidsskrift 2000, 112,8/9, side 599-603

Paratuberkulose, eller Johne’s disease, hos drøvtyggere skyldes en infeksjon i tarmveggen med Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M.paratuberculosis). Denne sykdommen er vidt utbredt i store deler av verden og fører til vesentlige tap i husdyrholdet. Paratuberkulose forekommer hos geit i Norge, men sykdommen kontrolleres ved bruk av en levende vaksine. Hos storfe hadde sykdommen ikke vært påvist siden slutten av syttitallet før en i 1997 påviste infeksjon i tarmen hos importert kjøttfe (1). Ved Norges veterinærhøgskole har det de siste årene blitt arbeidet med studier av opparbeidelsen av immunitet ved paratuberkulose og etablering av metoder for tidlig diagnostikk. Prosjektet har vært et samarbeid mellom Institutt for farmakololgi, mikrobiologi og næringsmiddelhygiene (FMN), Institutt for morfologi, genetikk og akvatisk biologi (MGA) og Institutt for stordyrsykdommer (Ist). Det har også blitt etablert et samarbeid med Veterinærinstituttet.I utgangspunktet har arbeidet vært finansiert med midler fra Norges Forskningsråd. For å kunne gjennomføre smitteforsøk på storfe har imidlertid også støtte fra Tine, Norsk Kjøtt, Geno og VESO vært avgjørende.

Mykobakterier
Mykobakterier forekommer normalt i jord og vann, og mange mykobakterieinfeksjoner forløper uten at verten utvikler sykdom. Det oppstår en likevekt mellom bakterien og vertens immunsvar. Andre infeksjoner er forbundet med utvikling av sykdom etter en lang symptomfri fase eller i forbindelse med immunsvikt. De saktevoksende bakteriene i Mycobacterium avium komplekset har lang generasjonstid. Dette fører til at tilfeldige forandringer i arvematerialet, som kan inntreffe hver gang en bakterie deler seg, oppstår relativt sjelden. Derfor ligner disse artene hverandre mye. Mycobacterium avium subsp. avium (M.avium) forårsaker tuberkulose hos fugl. Denne bakterien kan også infisere svin og drøvtyggere, men fører da kun til avgrensede forandringer i lymfeknuter og ingen sykdom. M.avium påvises jevnlig hos svin her til lands, men utbredelsen hos drøvtyggere er ikke kjent. Når en skal påvise immunreaksjoner mot infeksiøse agens, benytter en seg av mikrobenes proteiner. Disse plukker ut antistoffer eller immunceller fra dyret som er rettet mot mikroben. Den utstrakte likheten mellom mykobakterieartene gjør at det er vanskelig å finne proteiner som er tilstede kun hos én art. Dette fører til at immunsvar mot forskjellige mykobakteriearter, og særlig subspecies innen M.avium komplekset, lett kan forveksles. Det finnes flere forskergrupper som leter etter proteiner som bare finnes hos paratuberkulosebakterien. Så lenge en ikke kan bruke slike spesifikke proteiner i diagnostikken, vil mulige kryssreaksjoner være et problem.

Figur 1: Samspill mellom mykobakterieinfiserte makrofager og T-celler. Det gule feltet viser forhold som er beskrevet ved paratuberkuloseinfeksjon mens det hvite feltet viser forhold som er kjent ved andre mykobakterieinfeksjoner. T-hjelpe celler (CD4) kan reagere med en Th-1 eller en Th-2 respons når de møter en mykobakterieinfisert makrofag (Mj). Flere forskjellige cytokiner produsert av andre immunceller vil påvirke responsens retning. For ytterligere detaljer om dette se (15).Cytotoksiske T-celler (CD8) vil kunne drepe bakterieinfiserte makrofager. Da vil bakteriene frigjøres for siden å bli tatt opp av nye, aktiverte makrofager med nye muligheter for bakteriedrap. CD8 celler kan også produsere cytokiner og virke som regulatoriske celler. Gamma delta T-celler (gd T) har viktige funksjoner i immunresponsen mot mykobakterier og er spesielt viktige celler hos drøvtyggere. De kan produsere IFN-g , men kan også ha cytotoksiske funksjoner. For ytterligere detaljer om forskjellige T-cellers funksjon ved M.tuberculosis-infeksjon se (16).

Figur 2: Prinsippene ved påvisning av celleformidlet immunitet med interferongamma immuntest (ELISA test).

Smitte, immunitet og utvikling av sykdom
Paratuberkulose er i hovedsak en lokal infeksjon i tarmen og tilhørende lymfeknuter. Smitte skjer i ung alder via fôr og vann som er forurenset av avføring. I tynntarmen transporteres bakteriene inn i vevet av spesialiserte epitelceller (M-celler), og de vil siden bli tatt opp av lokale makrofager, celler som har til oppgave å ødelegge inntrengende mikrober (2). Etter som mykobakteriene har lipidrike strukturer i sin cellevegg, har de stor evne til å motstå makrofagenes drapsmekanismer, og de kan overleve inne i disse cellene. Makrofagene får støtte fra T-lymfocytter i kampen for å bli kvitt bakteriene; når de presenterer bakterieantigener til T-hjelpeceller (CD4+), vil T-hjelpecellene produsere stoffer (cytokiner) som blant annet stimulerer makrofagenes drapsmekanismer. Denne reaksjonsformen kalles en Th-1 respons. Særlig cytokinet gammainterferon (IFN-g) er viktig i denne sammenhengen. Andre T-celler har også vesentlige funksjoner ved mykobakterieinfeksjoner, men disse er ennå ikke beskrevet i detalj ved infeksjoner med M.paratuberculosis. En oversikt over T-cellenes og makrofagenes samspill ved mykobakterieinfeksjoner er vist i figur 1. T-lymfocytter som kjenner igjen mykobakterieantigener, vil formere seg. Noen blir effektorceller som utøver sin funksjon rundt infiserte makrofager i tarmen, mens andre blir huskeceller. De vil sirkulere med blod og lymfe på utkikk etter celler som er infisert med mykobakterier. M.paratuberculosis skader ikke cellen den befinner seg inne i. Sykdomsforandringene som oppstår er et resultat av vertens immunrespons. De forandringene som etableres rundt en mykobakterieinfisert makrofag kalles en type IV- reaksjon, en celleformidlet (forsinket) hypersensitivitetsreaksjon. Histologien vil vise aktiverte makrofager med en krans av IFN-g produserende lymfocytter, et granulom. Dette er vertens reaksjon for å kapsle inn og nøytralisere et fremmed agens den ikke klarer å kvitte seg med. Slik kan en likevekt mellom vert og bakterie bestå i mange år. På dette stadiet danner ikke dyret antistoffer mot bakterien. Det eneste tegnet på infeksjon kan være at det finnes huskeceller som kjenner igjen paratuberkulosebakterier i blodet. Dersom dyr avlives på dette stadiet, kan det være vanskelig å oppdage de små avgrensede granulomene som kun finnes noen få steder i tarmen (3,4).En endring av hjelpecellenes aktivitet fører til at cytokinet interleukin 4 (IL-4) produseres istedenfor IFN-g. Det er ukjent hva som fører til denne endringen. Sammen med en del andre cytokiner vil IL-4 stimulere B-celler til antistoffproduksjon (Th-2 respons). IL-4 hemmer også videre produksjon av cytokiner som stimulerer makrofagene (5). Resultatet blir økt forekomst av bakterier i tarmslimhinnen, og bakterier skilles ut med avføringen. En finner også antistoffer mot paratuberkulosebakterien i blodet. Forandringene i tarmen får i hovedsak karakter av en diffus granulomatøs betennelse med lymfocytter spredt rundt blant bakterieholdige makrofager, epiteloide celler og kjempeceller. Sykdom oppstår som følge av at forandringene i tarmveggen fører til endret næringsopptak, og etter hvert til diaré (oppstår kun hos storfe) og avmagring.

Måling av celleformidlet immunitet
Når en skal påvise infeksjon med paratuberkulose på et tidlig stadium, benytter en seg av huskecellene i blodet som kjenner igjen paratuberkulosebakterien. Ved å blande blodprøver med mykobakterieproteiner i laboratoriet, får en lymfocyttene til å reagere. Målinger av huskecellenes reaksjoner og produkter forteller at de er tilstede og eventuelt hvordan de reagerer. Dette er viktig både i diagnostikken og for forståelsen av hvordan dyr opparbeider immunitet ved paratuberkulose. Testene bygger på samme prinsipp som "skin testen" der mykobakterieproteiner introduseres i dyrets hud.Dersom et dyr er smittet med paratuberkulose og huskeceller med Th-1 profil finnes i blodet, produserer huskecellene IFN-g når de møter mykobakterieproteiner i laboratoriet. Dette cytokinet kan måles med en ELISA-test (figur 2). IFN-g testen ble opprinnelig utviklet til bruk i tuberkulose-diagnostikk hos storfe, og den er under etablering for bruk til diagnostikk av paratuberkulose.Vi har utført et smitteforsøk hos geit med paratuberkulose som strakk seg over to år.I forsøket så vi en tidlig, stabil IFN-g respons hos infiserte geiter, mens kontrollgeiter hadde lave verdier. IFN-g responsen vedvarte hos de infiserte geitene, selv om det etter hvert ble etablert en antistoffrespons og bakterier ble utskilt til tarm.Lymfocytter trenger stimuli fra cytokinet interleukin-2 (IL-2) for å kunne dele seg, og dette signalet tar de imot ved hjelp av IL-2 reseptorer. Vi har utviklet en test til bruk i paratuberkulosediagnostikk som beskriver lymfocyttenes responsevne ved å påvise og kvantifisere IL-2 reseptorer på deres overflate (6). Mens IFN-g testen kun påviser produksjon av et spesielt cytokin, påviser IL-2 reseptor testen en mer generell aktivering av lymfocytter. Ettersom denne testen er utviklet av vår gruppe og nesten utelukkende har vært benyttet på dyr podet med paratuberkulose, vil en større utprøving på naturlig infiserte dyr være nødvendig før metodens anvendelighet i diagnostikk kan evalueres. Vi arbeider nå med å forenkle metoden slik at den blir raskere og billigere å gjennomføre, og vi planlegger en større utprøving av metoden i samarbeid med forskergrupper i Danmark, som har stor tilgang på naturlig infiserte storfe i ulike sykdoms stadier.Ved å påvise IL-2 reseptor samtidig med andre cellemarkører, har vi mulighet til å bestemme hvilke lymfocytter som blir aktiverte ved møte med paratuberkuloseproteiner i laboratoriet. Dette er et nyttig redskap ved studier av immunforsvarets reaksjoner. Ved hjelp av metoden har vi vist at geiter som hadde et høyt nivå av mykobakterie-spesifikke T-lymfocytter med markøren CD8 et år etter infeksjon, hadde fravær av lesjoner i tarmen etter to år. Dyr som hadde utbredte forandringer i tarmen, hadde et lavt nivå av disse cellene. De CD8 positive lymfocyttene kan ha vært cytotoksiske celler. I vårt videre arbeid ønsker vi å etablere metoder som vil kunne påvise disse cellenes funksjon. Vi har også funnet en sammenheng mellom forekomst av utbredte lesjoner i tarmen og et høyt nivå av mykobakterie-spesifikke gd T-celler i blodet. Vi håper at immunhistokjemiske undersøkelser av lymfocyttene i tarmveggen og tarmens lymfeknuter som nå pågår vil kunne belyse dette funnet ytterligere.

Sammenheng mellom immunsvar i tarmen og forekomst av mykobakteriespesifikke lymfocytter i perifer sirkulasjon
Et viktig spørsmål i forbindelse med målinger av celleformidlet immunitet, er hvorvidt lymfocytter i perifer sirkulasjon gjenspeiler et bilde av den lymfocyttaktiviteten som finnes i tarmen. Det finnes en publikasjon med funn fra storfe som tyder på at det er tilfelle (7). I forbindelse med avlivingen av geitene i det tidligere nevnte forsøket ble det tatt ut lymfocytter fra tarmlymfeknuter og fra perifer sirkulasjon. Vi er nå i ferd med å analysere hvilke reaksjonsmønstre disse cellene har vist etter å ha blitt presentert for mykobakterieantigener. Det finnes i hovedsak to vidt forskjellige grunner til at en celleformidlet immunrespons i perifer sirkulasjon reduseres; 1) dyrene har kvittet seg med infeksjonen, eller 2) de har tapt kampen mot mykobakteriene og er i ferd med å utvikle sykdom. Dersom dyrene har kvittet seg med smitten (8,9) eller mengden smittestoff er kraftig redusert, har dyret ikke lenger en kontinuerlig stimulering av immunceller i tarmen, og mengden mykobakteriespesifikke lymfocytter i blodet vil avta. Dette var tilfelle hos to av syv dyr i vårt geiteforsøk. Dersom svekkelsen av celleformidlet immunitet er et ledd i utvikling av sykdom, følges den av en økning i produksjonen av antistoffer rettet mot M.paratuberculosis og utskillelse av bakterier til feces.

Immunsvar ved vaksinering
Etter som sykdommen paratuberkulose hos geit kontrolleres av en levende vaksine her i landet, er det av interesse å finne ut hva slags immunitet vaksinen forårsaker. Vi har utført studier der celleformidlet immunitet og antistoffproduksjon har blitt undersøkt etter vaksinasjon av unge kje. Vaksinerte kje var i ferd med å etablere en IFN-g respons allerede eller 3 uker, og etter seks uker hadde de en kraftig IFN-g respons i perifert blod. Først etter 12 uker kunne vi påvise en begynnende antistoffproduksjon. Den kraftige IFN-g responsen kan forklare hvordan unge dyr som er vaksinert har et immunsystem som er beredt til å eliminere eller begrense formeringen av paratuberkulosebakterier. På grunn av en viss mulighet for at svekkede vaksinestammer kan endre seg og fremkalle sykdom, reserverer mange lands myndigheter seg mot bruk av levende paratuberkulosevaksiner. Dessuten er det ikke endelig avklart om det kan være en sammenheng mellom paratuberkulosesmitte og Crohn's sykdom hos menneske (10,11). Derfor finnes det skepsis mot å introdusere levende paratuberkulosebakterier hos dyr som produserer melk til humant konsum. Den levende vaksinen skaper også problemer dersom en skal bruke immuntester til å overvåke paratuberkulose-situasjonen.

Paratuberkulose hos storfe
Paratuberkulose opptrer hos geit i Norge, men storfepopulasjonen har vært fri for sykdommen. Saxegaard (12) beskrev stammen av M.paratuberculosis som gir sykdom hos geit i Norge som apatogen for kalver, og antok at bakterien ikke førte til noe immunsvar hos verten. Konklusjonen var basert på fravær av antistoffer mot bakerien og fravær av forandringer i tarmen hos kalver som hadde vært infisert med bakterien i inntil 18 måneder. På bakgrunn av dette har det vært ansett for sannsynlig at vi har en geitestamme av M.paratuberculosis i Norge som ikke kan framkalle sykdom hos storfe. Denne situasjonen er blitt noe endret i det siste ettersom en har sett forekomst av antistoffer mot paratuberkulose hos flere storfebesetninger i Norge, og særlig fordi en del av disse besetningene har hatt kontakt med paratuberkulose infiserte geiter (13). På grunn av den genetiske stabiliteten hos paratuberkulosebakterien har en få muligheter til å skille ulike stammer. Det finnes i dag ikke metoder som kan skille de norske geitestammene av paratuberkulose fra stammer som gir sykdom hos storfe i andre europeiske land (14).I et forsøk der kalver ble podet med geitestammen av paratuberkulosebakterien, har vi nylig påvist at dyrene smittes, at de opparbeider celleformidlet immunitet og at de skiller ut bakterier i avføringen. Om immunreaksjonene vil kunne føre til at dyrene kvitter seg med bakteriene eller om de på sikt vil kunne utvikle forandringer i tarmen og sykdom, gjenstår å se.

Konklusjon
Både geitestammen og vaksinestammen av paratuberkulosebakterien vil kunne forårsake immunsvar hos storfe som kan interferere med immundiagnostikk. Etter som storfe smittes av geitestammen og kan skille ut bakterier med avføringen, er det ikke riktig å betrakte geit og storfe som to avskilte populasjoner hva paratuberkulose angår. Det vil ikke kunne forsvares å vaksinere geiter med en levende vaksine for å kontrollere sykdommen hos denne arten samtidig som en prøver å utrydde paratuberkulose hos storfe ved å slakte ned infiserte besetninger.For å kontrollere forekomsten av smitte hos geit, må det i første omgang settes i gang forsøk med bruk av inaktiverte vaksiner. Med de verktøy vi har etablert for karakterisering av celleformidlet immunitet, vil vi ha gode muligheter til å evaluere en inaktivert vaksine opp mot dagens levende vaksine. Likevel vil det være nødvendig med kontrollerte belastningsforsøk for å kunne evaluere hvilken beskyttelse vaksinen gir mot utvikling av sykdom, et prosjekt som vil kreve et visst tidsperspektiv. Dersom en på sikt går bort fra vaksine hos geit, og isteden ønsker å bekjempe forekomsten av bakterien, vil metodene som påviser et celleformidlet immunsvar være av stor betydning for å overvåke utbredelsen av smitte.

Etterord
Forfatteren takker alle som har bidratt til resultatene som presenteres i denne artikkelen. Spesielt nevnes Grete Berntsen, Hege Brun-Hansen, Berit Djønne, Hege Hasvold, Hans Jørgen Larsen og Mette Valheim.Early diagnosis of paratuberculosis in goats and cattleThe pathogenesis of paratuberculosis and the basic immunoassays measuring cellular immunity against paratuberculosis are briefly reviewed. The use of a living paratuberculosis vaccine in Norway causes problems in both diagnosis by faecal culture and immunoassays.The specific goat pathogenic Norwegian strain of paratuberculosis has been inoculated in calves, which established cellular immunity and excreted bacteria in faeces.  

Referanser 
1. Djønne B, Halldórsdóttir S, Holstad G, Sigurdardottir O, Ødegaard Ø. Paratuberkulose hos storfe. En sykdom som har fått ny aktualitet i Norge. Nor Vet Tidsskr 1998; 110: 713-7. 
2. Momotani E, Whipple DL, Thiermann AB, Cheville NF. Role of M cells and macrophages in the entrance of Mycobacterium paratuberculosis into domes of ileal Peyer's patches in calves. Vet Pathol 1988; 25: 131-7. 
3. Buergelt CD, Hall C, McEntee K, Duncan JR. Pathological evaluation of paratuberculosis in naturally infected cattle. Vet Pathol 1978; 15: 196-207. 
4. Sigurdardottir O, Press CM, Saxegaard F, Evensen O. Bacterial isolation, immunological response, and histopathological lesions during the early subclinical phase of experimental infection of goat kids with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Vet Pathol 1999; 36: 542-50. 
5. Sweeney RW, Jones DE, Habecker P, Scott P. Interferon-gamma and interleukin 4 gene expression in cows infected with Mycobacterium paratuberculosis. Am J Vet Res 1998; 59: 842-7. 
6. Whist SK, Storset AK, Larsen HJ. The use of interleukin-2 receptor expression as a marker of cell-mediated immunity in goats experimentally infected with Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Vet Immunol Immunopathol 2000; 73: 207-18. 
7. Burrells C, Clarke CJ, Colston A, Kay JM, Porter J, Little D et al. A study of immunological responses of sheep clinically-affected with paratuberculosis (Johne's disease). The relationship of blood, mesenteric lymph node and intestinal lymphocyte responses to gross and microscopic pathology. Vet Immunol Immunopathol 1998; 66: 343-58. 
8. Chiodini RJ, Van Kruiningen HJ, Merkal RS. Ruminant paratuberculosis (Johne's disease): The current status and future prospects. Cornell Vet 1984; 74: 218-62. 
9. Clarke CJ. The pathology and pathogenesis of paratuberculosis in ruminants and other species. J Comp Pathol 1997; 116: 217-61.
10. Mishina D, Katsel P, Brown ST, Gilberts EC, Greenstein RJ. On the etiology of Crohn disease. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93: 9816-20.
11. Van Kruiningen HJ. Lack of support for a common etiology in Johne's disease of animals and Crohn's disease in humans. Inflamm Bowel Dis 1999; 5: 183-91.
12. Saxegaard F. Experimental infection of calves with an apparently specific goat-pathogenic strain of Mycobacterium paratuberculosis. J Comp Pathol 1990; 102: 149-56.
13. Djønne B, Bratberg B, Holstad G, Jarp J, Nyberg O, Sigurdardottir O et al. Resultater fra overvåknings- og kontroll-programmet for paratuberkulose hos storfe. Husdyrforsøksmøtet. Ås 2000.147-50. 
14. Pavlik I, Horvathova A, Dvorska L, Bartl J, Svastova P, du Maine R et al. Standardisation of restriction fragment length polymorphism analysis for Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. J Microbiol Methods 1999; 38: 155-67. 
15. Reiner SL, Seder RA. T helper cell differentiation in immune response. Curr Opin Immunol 1995; 7: 360-6. 
16. Stenger S, Modlin RL. T cell mediated immunity to Mycobacterium tuberculosis. Curr Opin Microbiol 1999; 2: 89-93.